CRISPR/Cas9诱导的光激活DNAzyme探针用于细胞核锌离子的原位成像

金属离子在生物发展过程中扮演不可或缺的角色，对基因表达、酶活性和细胞信号传导等关键生命活动至关重要，并在维持细胞功能方面发挥着关键作用。在活细胞内，实现对金属离子在不同细胞器中时空分布的可视化成像对于全面了解金属信号及其在疾病状态中的调控作用具有至关重要的意义。然而，设计具备亚细胞分辨率的成像策略，特别是用于金属离子的原位成像，仍然是一个重大挑战。

近几年来，光激活的脱氧核酶（DNAzyme）探针因其良好的生物相容性和高时空分辨率而备受关注，广泛应用于可控的金属离子成像和分子诊断等领域。在前期研究的基础上，南京大学张晶晶副教授、清华大学向宇副教授和江苏科技大学郑芬芬副教授合作，提出了细胞核特异性CRISPR/Cas9诱导的光激活DNAzyme探针PC-TSDP的设计、合成和评估，用于精确成像细胞核中的Zn²⁺。

图1. CRISPR/Cas9诱导的光激活DNAzyme探针用于细胞核Zn²⁺的原位成像的设计策略。

首先，作者构建了一个包含底物链（S₁）、DNA酶链（S₂）和阻断链（S₃）的三链DNA酶探针（TSDP），其中S₂为Zn²⁺特异性的DNA酶。该设计中 S₃在与S₁和S₂退火组装形成TSDP后，需要具有足够的碱基长度以与S₂杂交，形成稳定的二级结构，防止S₁与S₂完全杂交，从而避免形成带有催化中心的DNA酶结构。另一方面，在TSDP经过Cas9/sgRNA介导的DNA双链断裂（DSB）过程后，剪切后的S₃由于其缩短的碱基长度导致其与S₂的熔链温度和结合力下降，剪切的S₃会与S₂发生链位移置换反应，生成用于Zn²⁺成像的DNA酶。为了满足这些条件，作者设计了三个不同长度的S₃链，通过NUPACK程序模拟了它们在DNA双链断裂过程和链位移置换反应中的行为，筛选出序列长度最优的S₃链，并辅以荧光光谱等实验，证明了该系统可以用于Zn²⁺的高灵敏、特异性检测。

图2. CRISPR/Cas9诱导的DNAzyme探针对Zn²⁺成像的作用机制。

接下来，作者将上述构建的TSDP探针与470 nm光诱导DNAzyme的脱笼策略结合，设计出细胞核特异性CRISPR/Cas9诱导的光激活DNAzyme探针PC-TSDP。通过激光共聚焦成像和流式细胞计数分析等实验，作者证明该设计允许光激活探针在细胞核中原位激活。最后，将该系统与三输入的AND逻辑门控策略集成，作者证明PC-TSDP可以用于核内Zn²⁺的高精度时空控制成像。

图3. 光激活PC-TSDP的核特异性Zn²⁺成像。

综上所述，作者成功开发了基于CRISPR/Cas9和470 nm光激活的双开关Zn²⁺成像系统。该系统结合了核特异性递送、时空控制的光激活和CRISPR/Cas9激活的优势，实现了细胞核内Zn²⁺的原位定位和光激活成像。此外，布尔逻辑门控策略和级联激活的结合进一步突出了其在精确监测肿瘤中Zn²⁺时空动态调控方面的实用性。由于许多金属离子特异性DNAzyme具有相似的活性结构，这种CRISPR/Cas9诱导的DNAzyme策略可以扩展到细胞核中其他金属离子的成像。总之，该研究为在亚细胞分辨率下研究金属离子的生物功能提供了一种新策略。

这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上，文章的通讯作者是南京大学的张晶晶副教授、清华大学的向宇副教授和江苏科技大学的郑芬芬副教授。

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Photoactivatable Engineering of CRISPR/Cas9-Inducible DNAzyme Probe for In Situ Imaging of Nuclear Zinc Ions

Ran Liu, Difei Jiang, Yangfang Yun, Zhe Feng, Fenfen Zheng,* Yu Xiang,* Huanhuan Fan, Jingjing Zhang*

Angew. Chem. Int. Ed., 2024, DOI: 10.1002/anie.202315536