UCSB杨扬/Pitt刘鹏团队Nat. Synth.：金属酶催化的立体选择性C(sp3)–H键氟化
自然界中虽然有很多无机氟化物，如氟化钙等，然而含有碳–氟键（C–F）的有机氟化物却非常稀少。有机氟化合物的研究，特别是含氟化合物的手性合成、氟生物催化和氟合成生物学长期以来一直吸引着合成化学家和合成生物学家。迄今为止，自然界中只有一类通过简单的双分子亲核取代 (SN2) 机制可以将氟原子引入到有机底物中构建C–F键的酶，该天然氟化酶催化S–腺苷甲硫氨酸转化为 5'–氟–5'–脱氧腺苷，进而合成相应含氟代谢物（图1a）。尽管α–酮戊二酸依赖的非血红素铁酶已经被广泛的研究并应用于C–H键的氯化、溴化、叠氮化以及硝化反应中，但是，将该类型卤化酶转变成氟化酶的研究并未有报道（图1b）。
图1. 天然氟化酶反应机制（a）和α-酮戊二酸依赖的非血红素依赖卤化酶反应机制（b）
以酶为核心的生物催化技术已成为药物绿色合成的重要手段，为精准控制不对称催化转化中的选择性调控提供了强有力的工具。在过去的十年中，关于非天然生物催化的创新性研究极大的拓展了天然酶的功能范围，实现了很多非天然反应的高效不对称转化。近日，美国加州大学圣塔芭芭拉分校（UCSB）杨扬教授和匹兹堡大学（Pitt）刘鹏教授合作在Nature Synthesis 上在线发表研究论文，实现了天然金属酶催化的立体选择性C(sp3)–H键氟化反应（图2）。
2021年，该研究团队将细胞色素P450改造为自由基反应的催化剂，实现了立体选择性的原子转移自由基环化（ATRC）反应（图3），为这一类型不对称自由基环化反应的实现提供了新的策略（Science, 2021, 374, 1612-1616, 点击阅读详细）。
图3. 酶催化的原子转移自由基环化（ATRC）反应在上述工作的基础上，作者设想通过金属氧化还原生物催化策略，在金属酶的存在下，高活性的N–氟底物形成Fe(III)–F物种，同时产生氮自由基，然后发生1,5–氢原子转移反应得到碳中心自由基，最后经过立体选择性的氟原子回弹实现C–F键的立体选择性构建（图4）。
首先，作者选择N–氟底物1a作为模型底物、大肠杆菌细胞为生物催化剂，对一系列血红素蛋白和非血红素蛋白进行筛选，结果显示对于血红素蛋白仅有还原产物3a被检测到；对于部分非血红素蛋白可以检测到初始反应活性。其中，来源于植物的非血红素蛋白1–氨基环丙烷–1–羧酸氧化酶（ACCO）可以取得0.9% yield，10:90 e.r.的最优初始活性，同时伴随有5.9%还原副产物3a的生成（图5）。
为了进一步提高该氟化酶的催化活性和选择性，作者开展了对ACCO的定向进化研究。首先，作者在蛋白晶体结构和分子对接模型的指导下，对活性中心周围的残基进行了定点饱和突变研究，奇怪的是，仅挖掘出了I184A这一有利突变。考虑到ACCO的天然底物为结构相对较小的1-氨基环丙烷-1-羧酸，接着作者对底物进入活性中心的通道进行了研究。实验发现，位于底物通道中β折叠上的K158残基对于控制反应的对映选择性起到关键作用，引入极性残基K158N，反应在对映选择性保持的情况下，反应活性有1.4倍的提升（2.3% ± 0.1% yield，19:81 e.r.）；将极性残基变成非极性的K158I，反应活性取得3.2倍的提升，同时反应的对映选择性发生反转（4.5% ± 0.2% yield，74:26 e.r.）。由于残基K158的α-碳原子距离活性中心的铁原子有10.8 Å，这一结果表明在该酶催化反应中距离较远的残基不仅影响反应的活性而且对反应的对映选择性产生影响。最终通过六轮的迭代定向进化，最终作者得到了ACCO I184A K158I F91L K172Y K93Q T89A (即ACCOCHF)，可以以97% ± 2% yield，95:5 e.r.，以及98:2的化学选择性和211 ± 5的化学转化数（TTN）得到氟化反应产物2a。进一步降低反应中酶的用量，可以取得820 ± 10的TTN，同时反应的化学选择性和对映选择性保持不变（图6）。
接下来，作者对该酶催化的不对称C–H键氟化反应的底物普适性进行了研究。结果显示，苯环上不同取代基（如：3–甲基（1b）、4–甲基（1c）、5–甲基（1d）、4–氟（1e）、4–氯（1f）、4–甲氧基（1g）以及酰胺取代基叔戊基（1h）和不同的侧链取代基基（1i–1m））均能兼容该反应，以良好至优异的产率、TTN以及对映选择性得到目标产物。值得注意的是，该反应可以较为容易的实现克量级制备，每升菌液可以以88%的收率得到1.5 克氟化产物，并且反应的对映选择性不发生变化（图7）。
为了进一步探究反应的机理，深入了解该生物催化 C(sp3)–H 键氟化反应的机制和活性位点残基的作用，作者使用经典分子动力学 (MD) 模拟和 DFT 计算进行了相关机理研究。首先，对底物1a与野生型ACCO和ACCOCHF突变体的复合物进行经典 MD 模拟，计算研究发现，底物1a靠近活性中心，并处于H234残基的反位时，该结构为最优的底物–酶结合模型。同时，对比野生型ACCO和ACCOCHF突变体，突变K158I、F91L、T89A突变体的引入，显著增加了底物进入酶活性中心的通道。此外，K158I和F91L突变显著增加了反应活性中心口袋的半径大小，从野生型ACCO的3.12 Å扩大到ACCOCHF突变体的4.17 Å。同时活性中心I184A突变的引入，使得底物可以更加靠近金属活性中心，同时减少了N–叔丁基和活性位点残基之间的不利相互作用（图8）。同时，作者对ACCO I184A K158I F91L K172Y、ACCO I184A K158I F91L K172Y K93Q 和ACCOCHF突变体进行动力学实验研究，实验发现，对于不同的突变体，kcat数值并未发生明显变化（2.1 min−1、2.5 min−1和2.3 min−1），KM则逐渐减小（依次为520 μM、420 μM和210 μM）。这一结果表明对于该不对称C–H键氟化反应，通过定向进化，提升了酶活性中心对于底物结合能力，进而提升了反应活性，这一实验结果和理论计算结果保持一致。
其次，为了阐明氟原子转移和氟回弹步骤的反应性，作者对这种生物催化C–H键氟化的反应能量分布进行了 DFT 计算。计算表明，第一步氟原子转移（TS–1）的活化能垒为11.8 kcal mol−1；氟原子转移后，氮中心自由基发生1,5–氢原子转移反应的活化能垒较低；最后，Fe(III)–F 物种通过自由基回弹形成 C–F 键的活化能垒为3.4 kcal mol−1（图9）。因此，作者推测对于整个过程，N–F键活化更可能为反应的决速步，而将底物1a中活化的 N-F 键转化为更强的Fe(III)–F键时的高放热性 (-14.3 kcal mol−1) 为底物活化提供了热力学驱动力。
本文研究通过定向进化开发了一种非血红素依赖的铁酶ACCOCHF，通过自由基机制实现了C(sp3) –H 键的高选择性氟化反应，为生物合成手性有机氟化合物提供了有价值的工具，对天然非血红素依赖的卤化酶重新用作氟化酶具有广泛的影响。UCSB杨扬教授和匹兹堡大学刘鹏教授为共同通讯作者，赵留鹏博士为论文第一作者，刘鹏教授课题组的Binh Khanh Mai完成了论文的计算部分。同时感谢UCSB本科生程立达、高方遒、赵云龙和UCSB郭瑞博士以及Boehringer Ingelheim公司的Hao Wu 和Yongda Zhang对本课题的帮助。原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：
Biocatalytic enantioselective C(sp3)–H fluorination enabled by directed evolution of non-haem iron enzymes
Liu-Peng Zhao, Binh Khanh Mai, Lida Cheng, Fangqiu Gao, Yunlong Zhao, Rui Guo, Hao Wu, Yongda Zhang, Peng Liu & Yang Yang Nat. Synth., 2024, DOI: 10.1038/s44160-024-00536-2
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