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格罗宁根大学Roelfes组Nature：首例以硼为催化中心的人工酶设计

催化

作者：X-MOL 2024-05-13

酶在提高化学生产的效益和效率方面发挥着越来越重要的作用，但由于酶的反应机制范围相对较窄，其应用的多样性严重落后于化学催化剂。含有非生物功能的酶的产生促进了自然界经典之外反应机制的发现，并为完全可编程的生物催化铺平了道路。最近，荷兰格罗宁根大学的Gerard Roelfes教授（点击查看介绍）课题组在Nature 上发表文章，通过遗传密码拓展技术在蛋白骨架中引入含硼酸的非天然氨基酸（pBoF），创制硼酸为催化中心的人工酶（BOS）。该人工酶实现了首例酶促不对称的硼催化反应，通过催化肟的形成实现了安息香类化合物的不对称动力学拆分。

硼元素含量在地球上相对丰富，但却没有作为催化中心的元素直接参与到天然反应中。其中硼酸是非常强大的催化剂，其底物活化模式多样，反应中可与底物形成氢键、酸酐或表现出Lewis酸或Brønsted酸能力等等。但由于硼酸催化剂通常需要芳基取代基来确保适当酸度和稳定性，因此构建其手性催化剂非常困难，虽然已有几个硼酸偶联手性硫脲或胺的催化剂设计以实现手性催化的例子，但到目前为止，硼酸作为单一催化中心以实现手性催化的反应仅有一例（图1a）。

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图1. 硼催化总述

作者认为设计硼酸为催化中心的酶是实现手性硼酸催化的完美途径，因为定向进化可以通过改变蛋白骨架的环境来提高反应选择性并实现不同的反应途径。遗传密码拓展技术（琥珀终止密码子抑制技术）是一种日趋成熟且易于应用的技术，目前已用于设计使用非天然氨基、亲核试剂（Nature, 2019, 570, 219）或光敏剂的非天然酶（图1b）。硼元素可以在蛋白质中被遗传编码为对硼苯基丙氨酸（pBoF），该非经典氨基酸（ncAA）已在蛋白质的生物偶联和生物正交标记中得到应用（Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 8220）。因此，作者使用pBoF作为酶中的催化残基来证明基于ncAA的酶设计的全部潜力，该酶通过非天然机制运行，而仅使用天然蛋白组成单元无法构建。作者设想利用硼酸对邻位二醇的亲和力来催化缩合反应，邻位二醇在对带有羟基导向基团的羰基进行亲核攻击后瞬时形成（图1c）。硼酸通过共价环状硼酸酯的形成来活化底物，而不是Lewis/Brønsted酸活化或使用氧阴离子孔的典型生物催化策略（图1c）。该研究证明设计人工硼酸酶可催化α-羟基酮与羟胺的立体选择性缩合，通过形成肟实现羟基酮的动力学拆分，后续定向进化中鉴定出一种具有高度对映选择性的变体，并深入了解了其独特的硼依赖性机制。

基于实验室已有基础，作者首先在乳酸乳球菌多药耐药性调节因子（LmrR）尝试插入含硼酸的非天然氨基酸。尽管该蛋白骨架缺乏天然催化功能，但由于其结构独特且可进化，已有多篇作为人工酶的骨架实现非天然反应的报道（Nature. 2022, 611, 715; Nat. Catal. 2020, 3, 289; Nat. Chem. 2018, 10, 946）。作者选择LmrR蛋白中的6个位置（8、11、15、89、92和93）用于pBoF的插入，使用羟胺作为简单亲核试剂，与适当的α-羟基酮可形成一种瞬态邻二醇中间体，该中间体在硼酸催化下加速脱水后产生相应的肟（图2b）。值得一提的是该含肟产物由胺底物通过非立体选择性氧化形成，而不是通过各自羰基的亲核取代，并且是醛肟，而不是在硼催化过程中形成的酮肟。作者选择外消旋安息香(Rac)-1a作为模式底物，并提出蛋白骨架的化学环境可导致一种对映体的优先转化，从而导致α-羟酮的动力学拆分（图2b）。每种插入pBoF的LmrR变体都给出了高于背景以及LmrR_wt的肟产物 (E)-2a和 (Z)-2a的显著产率。值得一提的是，LmrR_M89Y（最接近pBoF的天然氨基酸）与游离pBoF均没有显示出活性，表明pBoF侧链在LmrR骨架中的关键催化作用。

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图2. 含硼人工酶的设计与催化验证

在定向进化工作中，作者首先对BOS进行丙氨酸扫描，并验证pBoF残基临近位置具有普遍可变性。突变体BOS_F93A不仅显示出催化活性和对映选择性的显著提高，还可以通过紫外-可见（UV/Vis）光谱在96孔板粗酶反应中直接检测 (R)-1a的消耗，为后续定向进化提供良好模板与方案。在第一轮进化中，对靠近pBoF的四个位置（M8、L18、A92和F93）进行位点饱和诱变（SSM），并鉴定BOS_F93E为最佳突变体。以BOS_F93E为模板，继续对M8、V15、K22和A92进行SSM，得到进化突变体BOS_F93E_M8H和BOS_F93E_A92L。将第二轮阳性突变组合产生BOS_F93E_M8H_A92L（BOS_EHL）时，两位点表现出强大的协同效应，其E值高达146，并且观察到的速率常数提高了33倍（图3b）。其优异的选择性几乎与天然酶的天然底物相当。邻位取代的安息香衍生物（1k–1m）显示出比其对位取代的化合物更低的活性。类似地，对手性中心周围空间体积大大减少的底物1n、1o、1p和1q，只有改进的突变体BOS_EHL显示出令人满意的转化率，尽管选择性降低（图3c）。作者使用乙酰化的安息香和β-羟基酮作为未转化的对照底物，表明了底物形成硼催化机理的瞬态邻二醇的必要性。为证明开发的肟合成方法的适用性，作者使用BOS_EHL进行了500倍放大实验，其中以52%和37%的产率分离出对映体富集的起始原料 (S)-1a和产物 (R)-2a，其对映体过量分别为89%和91%（图3c）。

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图3. BOS的定向进化与底物谱拓展

作者后续对该反应机理与蛋白骨架催化中发挥作用进入深入研究与探讨。在没有底物的情况下，BOS中的硼中心以低价硼酸（sp²）形式存在，¹¹B NMR分析显示在23 ppm和19 ppm的低价sp²杂化的硼物种特征（图4b）。两个信号的存在处于pH依赖性平衡（图4b）。作者获得了2.2 Å的BOS晶体结构（pH 6），这也与pBoF残基的sp²杂化的硼酸状态一致（图4c）。催化第一步涉及邻二醇与硼酸静息态的结合，并产生sp³杂化的环状硼酸酯中间体。正如用HRMS观察到的那样，在BOS与4-硝基儿茶醇孵育后，几乎定量地形成环状硼酸酯中间体（图4a），¹¹B NMR光谱中在8.6处显示出特征性的高场移硼酸sp³杂化状态。BOS和BOS_EHL与不同的氢苯偶姻对映体的结合程度并未显示出显著差异，这表明瞬时二醇结合不是立体选择性的决定步骤。在仅加入安息香（1a）下，¹¹B NMR或HRMS观察到BOS并未形成硼酸酯，该结果表明瞬时邻二醇中间体才可作为催化底物，而不是经典路易斯酸性下羰基活化的底物。通过¹¹B NMR和HRMS观察到产物2a与BOS孵育后形成的环状硼酸酯中间体，为催化循环中最后中间体的表征提供了直接证据。BOS_EHL的表征与BOS一致，因此很可能遵循相同的催化机制。

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图4. 催化机制的验证

最后，作者解析了BOS与BOS_EHL晶体结构。BOS的晶体结构显示硼酸残基和N19之间的氢键相互作用，其跨越LmrR的“铰链”区域的α1和α4螺旋，使疏水腔强烈收缩（图4c）。N19残基对环状硼酸酯的形成具有关键影响，BOS_N19A失去催化能力。F93阻断了催化硼位点，将其突变为丙氨酸或谷氨酸将增加了催化活性。作者同样获得了BOS_EHL的1.7 Å晶体结构，其显示出与BOS总体相似的结构，并存在结合在pBoF残基上的Tris分子所形成四方环状硼酸酯。BOS_EHL中，N19侧链的酰胺、氧原子与硼酸酯和底物羟基之间观察到双氢键相互作用（图4d）。这些结果表明，硼酸催化位点与蛋白质骨架的相互作用共同创制了酶BOS，其反应性在自然界中是前所未有的。

总结

本研究展示了一种基因编码的含硼酸中心的人工酶，具有天然或工程化生物催化剂无法实现的有机催化能力。这种硼酶通过肟的形成以催化羟基酮的不对称动力学拆分，硼酸催化残基与蛋白骨架关键相互作用有助于催化进程。后续定向进化获得了对几种不同底物具有天然酶类似对映选择性的进化变体，并利用X射线晶体学、高分辨率质谱（HRMS）和¹¹B NMR光谱证实了硼酶的独特激活模式。该研究表明，遗传密码扩展可用于创制可进化的依赖外源催化单元（如硼酸）的对映选择性酶，并可实现天然酶或工程酶的催化混杂无法实现的反应机制。

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