STUDY QUESTION Are sperm phospholipase C zeta (PLCζ) profiles linked to the quality of embryogenesis and pregnancy? SUMMARY ANSWER Sperm PLCζ levels in both mouse and humans correlate with measures of ideal embryogenesis whereby minimal levels seem to be required to result in successful pregnancy. WHAT IS KNOWN ALREADY While causative factors underlying male infertility are multivariable, cases are increasingly associated with the efficacy of oocyte activation, which in mammals occurs in response to specific profiles of calcium (Ca2+) oscillations driven by sperm-specific PLCζ. Although sperm PLCζ abrogation is extensively linked with human male infertility where oocyte activation is deficient, less is clear as to whether sperm PLCζ levels or localization underlies cases of defective embryogenesis and failed pregnancy following fertility treatment. STUDY DESIGN, SIZE, DURATION A cohort of 54 couples undergoing fertility treatment were recruited at the assisted reproductive technology laboratory at the King Faisal Hospital and Research Centre, Riyadh, Kingdom of Saudi Arabia. The recruitment criteria for males was a minimum sperm concentration of 5×106 sperm/ml, while all female patients had to have at least five oocytes. Sperm PLCζ analysis was performed in research laboratories, while semen assessments were performed, and time-lapse morphokinetic data were obtained, in the fertility clinic as part of routine treatment. The CRISPR/Cas9 system was concurrently used to induce indels and single-nucleotide mutations within the Plcζ gene to generate strains of Plcζ mutant mice. Sperm PLCζ was evaluated using immunofluorescence and immunoblotting with an antibody of confirmed consistent specificity against PLCζ. PARTICIPANTS/MATERIALS, SETTING, METHODS We evaluated PLCζ profiles in sperm samples from 54 human couples undergoing fertility treatment in the context of time-lapse morphokinetic analysis of resultant embryos, correlating such profiles to pregnancy status. Concurrently, we generated two strains of mutant Plcζ mice using CRISPR/Cas9, and performed IVF with wild type (WT) oocytes and using WT or mutant Plcζ sperm to generate embryos. We also assessed PLCζ status in WT and mutant mice sperm in the context of time-lapse morphokinetic analysis and breeding outcomes. MAIN RESULTS AND THE ROLE OF CHANCE A significant (P ≤ 0.05) positive relationship was observed between both PLCζ relative fluorescence and relative density with the times taken for both the second cell division (CC2) (r = 0.26 and r = 0.43, respectively) and the third cell division (S2) (r = 0.26). Examination of localization patterns also indicated significant correlations between the presence or absence of sperm PLCζ and CC2 (r = 0.27 and r = −0.27, respectively; P ≤ 0.025). Human sperm PLCζ levels were at their highest in the ideal times of CC2 (8–12 h) compared to time ranges outside the ideal timeframe (<8 and >12 h) where levels of human sperm PLCζ were lower. Following assignment of PLCζ level thresholds, quantification revealed a significantly higher (P ≤ 0.05) rate of successful pregnancy in values larger than the assigned cut-off for both relative fluorescence (19% vs 40%, respectively) and relative density (8% vs 54%, respectively). Immunoblotting indicated a single band for PLCζ at 74 kDa in sperm from WT mice, while a single band was also observed in sperm from heterozygous of Plcζ mutant mouse sperm, but at a diminished intensity. Immunofluorescent analysis indicated the previously reported (Kashir et al., 2021) fluorescence patterns in WT sperm, while sperm from Plcζ mutant mice exhibited a significantly diminished and dispersed pattern at the acrosomal region of the sperm head. Breeding experiments indicated a significantly reduced litter size of mutant Plcζ male mice compared to WT mice, while IVF-generated embryos using sperm from mutant Plcζ mice exhibited high rates of polyspermy, and resulted in significantly reduced numbers of these embryos reaching developmental milestones. LIMITATIONS, REASONS FOR CAUTION The human population examined was relatively small, and should be expanded to examine a larger multi-centre cohort. Infertility conditions are often multivariable, and it was not possible to evaluate all these in human patients. However, our mutant Plcζ mouse experiments do suggest that PLCζ plays a significant role in early embryo development. WIDER IMPLICATIONS OF THE FINDINGS We found that minimal levels of PLCζ within a specific range were required for optimal early embryogenesis, correlating with increased pregnancy. Levels of sperm PLCζ below specific thresholds were associated with ineffective embryogenesis and lower pregnancy rates, despite eliciting successful fertilization in both mice and humans. To our knowledge, this represents the first time that PLCζ levels in sperm have been correlated to prognostic measures of embryogenic efficacy and pregnancy rates in humans. Our data suggest for the first time that the clinical utilization of PLCζ may stand to benefit not just a specific population of male infertility where oocyte activation is completely deficient (wherein PLCζ is completely defective/abrogated), but also perhaps the larger population of couples seeking fertility treatment. STUDY FUNDING/COMPETING INTEREST(S) J.K. is supported by a faculty start up grant awarded by Khalifa University (FSU-2023-015). This study was also supported by a Healthcare Research Fellowship Award (HF-14-16) from Health and Care Research Wales (HCRW) to J.K., alongside a National Science, Technology, and Innovation plan (NSTIP) project grant (15-MED4186-20) awarded by the King Abdulaziz City for Science and Technology (KACST) for J.K. and A.M.A. The authors declare no conflicts of interest. TRIAL REGISTRATION NUMBER N/A.

中文翻译：

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哺乳动物精子因子磷脂酶 C zeta 对于人类和小鼠的早期胚胎分裂和妊娠至关重要

研究问题 精子磷脂酶 C zeta (PLCζ) 谱与胚胎发生和妊娠的质量有关吗？摘要答案 小鼠和人类的精子 PLC 水平与理想胚胎发生的测量相关，因此似乎需要最低水平才能成功怀孕。已知的情况虽然男性不育的致病因素是多变量的，但病例越来越多地与卵母细胞激活的功效相关，在哺乳动物中，卵母细胞激活是对精子特异性 PLC 驱动的特定钙 (Ca2+) 振荡作出反应而发生的。尽管精子 PLC 的废除与卵母细胞活化不足的人类男性不育症密切相关，但精子 PLC 的水平或定位是否是生育治疗后胚胎发生缺陷和妊娠失败的原因尚不清楚。研究设计、规模、持续时间 在沙特阿拉伯王国利雅得费萨尔国王医院和研究中心的辅助生殖技术实验室招募了 54 对接受生育治疗的夫妇。男性的招募标准是最低精子浓度为5×106个精子/ml，而所有女性患者必须拥有至少5个卵母细胞。作为常规治疗的一部分，在研究实验室进行了精子 PLCze 分析，同时在生育诊所进行了精液评估并获得了延时形态动力学数据。 CRISPR/Cas9系统同时用于诱导Plcz基因内的插入缺失和单核苷酸突变，以产生Plcz突变小鼠品系。使用免疫荧光和免疫印迹法，使用已证实对 PLC 具有一致特异性的抗体来评估精子 PLC 。参与者/材料、环境、方法 我们在对所得胚胎进行延时形态动力学分析的背景下，评估了 54 对接受生育治疗的人类夫妇的精子样本中的 PLCze 谱，并将这些谱与妊娠状态相关联。同时，我们使用 CRISPR/Cas9 生成了两种突变型 Plcze 小鼠，并使用野生型 (WT) 卵母细胞进行 IVF，并使用 WT 或突变型 Plcze 精子生成胚胎。我们还在延时形态动力学分析和育种结果的背景下评估了 WT 和突变小鼠精子中的 PLCze 状态。主要结果和机会的作用 在 PLC 相对荧光和相对密度与第二次细胞分裂 (CC2) 所需时间之间观察到显着 (P ≤ 0.05) 正相关关系（分别为 r = 0.26 和 r = 0.43）和第三次细胞分裂 (S2) (r = 0.26)。对定位模式的检查还表明精子 PLC 和 CC2 的存在或不存在之间存在显着相关性（分别为 r = 0.27 和 r = -0.27；P ≤ 0.025）。与理想时间范围之外的时间范围（<8 和>12 小时）相比，人类精子 PLCz 水平在 CC2 的理想时间（8-12 小时）内达到最高，此时人类精子 PLCz 水平较低。在指定 PLCz 水平阈值后，​​定量显示，相对荧光（分别为 19% 与 40%）和相对密度（8% 与分别为 54%）。免疫印迹表明，WT 小鼠精子中存在 74 kDa 的 PLCζ 单条带，而 Plcζ 突变小鼠精子杂合子的精子中也观察到单条带，但强度有所减弱。免疫荧光分析表明，WT 精子中的荧光模式与先前报道的 (Kashir et al., 2021) 一致，而 Plcze 突变小鼠的精子在精子头部顶体区域表现出显着减少和分散的模式。繁殖实验表明，与野生型小鼠相比，突变型 Plcze 雄性小鼠的产仔数显着减少，而使用突变型 Plcze 小鼠精子进行 IVF 生成的胚胎表现出较高的多精率，并导致这些胚胎达到发育里程碑的数量显着减少。局限性和注意理由 所检查的人群相对较小，应扩大范围以检查更大的多中心队列。不孕症的情况通常是多变量的，不可能在人类患者中评估所有这些情况。然而，我们的突变型 Plc z 小鼠实验确实表明 PLC z 在早期胚胎发育中发挥着重要作用。研究结果的更广泛意义 我们发现，最佳早期胚胎发生需要特定范围内的最低 PLC 水平，这与妊娠率的增加相关。尽管在小鼠和人类中都能成功受精，但低于特定阈值的精子 PLC 水平与无效的胚胎发生和较低的妊娠率相关。据我们所知，这代表精子中的 PLCze 水平首次与人类胚胎发生效率和妊娠率的预后指标相关联。我们的数据首次表明，PLCze 的临床应用可能不仅有利于卵母细胞激活完全缺陷的特定男性不育人群（其中 PLCz 完全有缺陷/废除），而且可能还有利于更多寻求不孕症的夫妇。生育治疗。学习经费/竞争利益 JK 得到哈利法大学授予的教师启动补助金 (FSU-2023-015) 的支持。这项研究还得到了威尔士健康与护理研究中心 (HCRW) 授予 JK 的医疗保健研究奖学金 (HF-14-16) 以及国家科学、技术和创新计划 (NSTIP) 项目拨款 (15-MED4186- 20) 由​​阿卜杜勒阿齐兹国王科技城 (KACST) 授予 JK 和 AMA 作者声明不存在利益冲突。试用注册号 不适用。05) 成功妊娠率，其值大于相对荧光（分别为 19% 与 40%）和相对密度（分别为 8% 与 54%）的指定截止值。免疫印迹表明，WT 小鼠精子中存在 74 kDa 的 PLCζ 单条带，而 Plcζ 突变小鼠精子杂合子的精子中也观察到单条带，但强度有所减弱。免疫荧光分析表明，WT 精子中的荧光模式与先前报道的 (Kashir et al., 2021) 一致，而 Plcze 突变小鼠的精子在精子头部顶体区域表现出显着减少和分散的模式。繁殖实验表明，与野生型小鼠相比，突变型 Plcze 雄性小鼠的产仔数显着减少，而使用突变型 Plcze 小鼠精子进行 IVF 生成的胚胎表现出较高的多精率，并导致这些胚胎达到发育里程碑的数量显着减少。局限性和注意理由 所检查的人群相对较小，应扩大范围以检查更大的多中心队列。不孕症的情况通常是多变量的，不可能在人类患者中评估所有这些情况。然而，我们的突变型 Plc z 小鼠实验确实表明 PLC z 在早期胚胎发育中发挥着重要作用。研究结果的更广泛意义 我们发现，最佳早期胚胎发生需要特定范围内的最低 PLC 水平，这与妊娠率的增加相关。尽管在小鼠和人类中都能成功受精，但低于特定阈值的精子 PLC 水平与无效的胚胎发生和较低的妊娠率相关。据我们所知，这代表精子中的 PLCze 水平首次与人类胚胎发生效率和妊娠率的预后指标相关联。我们的数据首次表明，PLCze 的临床应用可能不仅有利于卵母细胞激活完全缺陷的特定男性不育人群（其中 PLCz 完全有缺陷/废除），而且可能还有利于更多寻求不孕症的夫妇。生育治疗。学习经费/竞争利益 JK 得到哈利法大学授予的教师启动补助金 (FSU-2023-015) 的支持。这项研究还得到了威尔士健康与护理研究中心 (HCRW) 授予 JK 的医疗保健研究奖学金 (HF-14-16) 以及国家科学、技术和创新计划 (NSTIP) 项目拨款 (15-MED4186- 20) 由​​阿卜杜勒阿齐兹国王科技城 (KACST) 授予 JK 和 AMA 作者声明不存在利益冲突。试用注册号 不适用。05) 成功妊娠率，其值大于相对荧光（分别为 19% 与 40%）和相对密度（分别为 8% 与 54%）的指定截止值。免疫印迹表明，WT 小鼠精子中存在 74 kDa 处的 PLCζ 单条带，而 Plcζ 突变小鼠精子杂合子中也观察到单条带，但强度有所减弱。免疫荧光分析表明，WT 精子中的荧光模式与先前报道的 (Kashir et al., 2021) 一致，而 Plcze 突变小鼠的精子在精子头部顶体区域表现出显着减少和分散的模式。繁殖实验表明，与野生型小鼠相比，突变型 Plcze 雄性小鼠的产仔数显着减少，而使用突变型 Plcze 小鼠精子进行 IVF 生成的胚胎表现出较高的多精率，并导致这些胚胎达到发育里程碑的数量显着减少。局限性和注意理由 所检查的人群相对较小，应扩大范围以检查更大的多中心队列。不孕症的情况通常是多变量的，不可能在人类患者中评估所有这些情况。然而，我们的突变型 Plc z 小鼠实验确实表明 PLC z 在早期胚胎发育中发挥着重要作用。研究结果的更广泛意义 我们发现，最佳早期胚胎发生需要特定范围内的最低 PLC 水平，这与妊娠率的增加相关。尽管在小鼠和人类中都能成功受精，但低于特定阈值的精子 PLC 水平与无效的胚胎发生和较低的妊娠率相关。据我们所知，这代表精子中的 PLCze 水平首次与人类胚胎发生效率和妊娠率的预后指标相关联。我们的数据首次表明，PLCze 的临床应用可能不仅有利于卵母细胞激活完全缺陷的特定男性不育人群（其中 PLCz 完全有缺陷/废除），而且可能还有利于更多寻求不孕症的夫妇。生育治疗。学习经费/竞争利益 JK 得到哈利法大学授予的教师启动补助金 (FSU-2023-015) 的支持。这项研究还得到了威尔士健康与护理研究中心 (HCRW) 授予 JK 的医疗保健研究奖学金 (HF-14-16) 以及国家科学、技术和创新计划 (NSTIP) 项目拨款 (15-MED4186- 20) 由​​阿卜杜勒阿齐兹国王科技城 (KACST) 授予 JK 和 AMA 作者声明不存在利益冲突。试用注册号 不适用。同时，在 Plcze 突变小鼠精子杂合子的精子中也观察到单条带，但强度有所减弱。免疫荧光分析表明，WT 精子中的荧光模式与先前报道的 (Kashir et al., 2021) 一致，而 Plcze 突变小鼠的精子在精子头部顶体区域表现出显着减少和分散的模式。繁殖实验表明，与野生型小鼠相比，突变型 Plcze 雄性小鼠的产仔数显着减少，而使用突变型 Plcze 小鼠精子进行 IVF 生成的胚胎表现出较高的多精率，并导致这些胚胎达到发育里程碑的数量显着减少。局限性和注意理由 所检查的人群相对较小，应扩大范围以检查更大的多中心队列。不孕症的情况通常是多变量的，不可能在人类患者中评估所有这些情况。然而，我们的突变型 Plc z 小鼠实验确实表明 PLC z 在早期胚胎发育中发挥着重要作用。研究结果的更广泛意义 我们发现，最佳早期胚胎发生需要特定范围内的最低 PLC 水平，这与妊娠率的增加相关。尽管在小鼠和人类中都能成功受精，但低于特定阈值的精子 PLC 水平与无效的胚胎发生和较低的妊娠率相关。据我们所知，这代表精子中的 PLCze 水平首次与人类胚胎发生效率和妊娠率的预后指标相关联。我们的数据首次表明，PLCze 的临床应用可能不仅有利于卵母细胞激活完全缺陷的特定男性不育人群（其中 PLCz 完全有缺陷/废除），而且可能还有利于更多寻求不孕症的夫妇。生育治疗。学习经费/竞争利益 JK 得到哈利法大学授予的教师启动补助金 (FSU-2023-015) 的支持。这项研究还得到了威尔士健康与护理研究中心 (HCRW) 授予 JK 的医疗保健研究奖学金 (HF-14-16) 以及国家科学、技术和创新计划 (NSTIP) 项目拨款 (15-MED4186- 20) 由​​阿卜杜勒阿齐兹国王科技城 (KACST) 授予 JK 和 AMA 作者声明不存在利益冲突。试用注册号 不适用。同时，在 Plcze 突变小鼠精子杂合子的精子中也观察到单条带，但强度有所减弱。免疫荧光分析表明，WT 精子中的荧光模式与先前报道的 (Kashir et al., 2021) 一致，而 Plcze 突变小鼠的精子在精子头部顶体区域表现出显着减少和分散的模式。繁殖实验表明，与野生型小鼠相比，突变型 Plcze 雄性小鼠的产仔数显着减少，而使用突变型 Plcze 小鼠精子进行 IVF 生成的胚胎表现出较高的多精率，并导致这些胚胎达到发育里程碑的数量显着减少。局限性和注意理由 所检查的人群相对较小，应扩大范围以检查更大的多中心队列。不孕症的情况通常是多变量的，不可能在人类患者中评估所有这些情况。然而，我们的突变型 Plc z 小鼠实验确实表明 PLC z 在早期胚胎发育中发挥着重要作用。研究结果的更广泛意义 我们发现，最佳早期胚胎发生需要特定范围内的最低 PLC 水平，这与妊娠率的增加相关。尽管在小鼠和人类中都能成功受精，但低于特定阈值的精子 PLC 水平与无效的胚胎发生和较低的妊娠率相关。据我们所知，这代表精子中的 PLCze 水平首次与人类胚胎发生效率和妊娠率的预后指标相关联。我们的数据首次表明，PLCze 的临床应用可能不仅有利于卵母细胞激活完全缺陷的特定男性不育人群（其中 PLCz 完全有缺陷/废除），而且可能还有利于更多寻求不孕症的夫妇。生育治疗。学习经费/竞争利益 JK 得到哈利法大学授予的教师启动补助金 (FSU-2023-015) 的支持。这项研究还得到了威尔士健康与护理研究中心 (HCRW) 授予 JK 的医疗保健研究奖学金 (HF-14-16) 以及国家科学、技术和创新计划 (NSTIP) 项目拨款 (15-MED4186- 20) 由​​阿卜杜勒阿齐兹国王科技城 (KACST) 授予 JK 和 AMA 作者声明不存在利益冲突。试用注册号 不适用。并导致达到发育里程碑的胚胎数量显着减少。局限性和注意理由 所检查的人群相对较小，应扩大范围以检查更大的多中心队列。不孕症的情况通常是多变量的，不可能在人类患者中评估所有这些情况。然而，我们的突变型 Plc z 小鼠实验确实表明 PLC z 在早期胚胎发育中发挥着重要作用。研究结果的更广泛意义 我们发现，最佳早期胚胎发生需要特定范围内的最低 PLC 水平，这与妊娠率的增加相关。尽管在小鼠和人类中都能成功受精，但低于特定阈值的精子 PLC 水平与无效的胚胎发生和较低的妊娠率相关。据我们所知，这代表精子中的 PLCze 水平首次与人类胚胎发生效率和妊娠率的预后指标相关联。我们的数据首次表明，PLCze 的临床应用可能不仅有利于卵母细胞激活完全缺陷的特定男性不育人群（其中 PLCz 完全有缺陷/废除），而且可能还有利于更多寻求不孕症的夫妇。生育治疗。学习经费/竞争利益 JK 得到哈利法大学授予的教师启动补助金 (FSU-2023-015) 的支持。这项研究还得到了威尔士健康与护理研究中心 (HCRW) 授予 JK 的医疗保健研究奖学金 (HF-14-16) 以及国家科学、技术和创新计划 (NSTIP) 项目拨款 (15-MED4186- 20) 由​​阿卜杜勒阿齐兹国王科技城 (KACST) 授予 JK 和 AMA 作者声明不存在利益冲突。试用注册号 不适用。并导致达到发育里程碑的胚胎数量显着减少。局限性和注意理由 所检查的人群相对较小，应扩大范围以检查更大的多中心队列。不孕症的情况通常是多变量的，不可能在人类患者中评估所有这些情况。然而，我们的突变型 Plc z 小鼠实验确实表明 PLC z 在早期胚胎发育中发挥着重要作用。研究结果的更广泛意义 我们发现，最佳早期胚胎发生需要特定范围内的最低 PLC 水平，这与妊娠率的增加相关。尽管在小鼠和人类中都能成功受精，但低于特定阈值的精子 PLC 水平与无效的胚胎发生和较低的妊娠率相关。据我们所知，这代表精子中的 PLCze 水平首次与人类胚胎发生效率和妊娠率的预后指标相关联。我们的数据首次表明，PLCze 的临床应用可能不仅有利于卵母细胞激活完全缺陷的特定男性不育人群（其中 PLCz 完全有缺陷/废除），而且可能还有利于更多寻求不孕症的夫妇。生育治疗。学习经费/竞争利益 JK 得到哈利法大学授予的教师启动补助金 (FSU-2023-015) 的支持。这项研究还得到了威尔士健康与护理研究中心 (HCRW) 授予 JK 的医疗保健研究奖学金 (HF-14-16) 以及国家科学、技术和创新计划 (NSTIP) 项目拨款 (15-MED4186- 20) 由​​阿卜杜勒阿齐兹国王科技城 (KACST) 授予 JK 和 AMA 作者声明不存在利益冲突。试用注册号 不适用。我们的数据首次表明，PLCze 的临床应用可能不仅有利于卵母细胞激活完全缺陷的特定男性不育人群（其中 PLCz 完全有缺陷/废除），而且可能还有利于更多寻求不孕症的夫妇。生育治疗。学习经费/竞争利益 JK 得到哈利法大学授予的教师启动补助金 (FSU-2023-015) 的支持。这项研究还得到了威尔士健康与护理研究中心 (HCRW) 授予 JK 的医疗保健研究奖学金 (HF-14-16) 以及国家科学、技术和创新计划 (NSTIP) 项目拨款 (15-MED4186- 20) 由​​阿卜杜勒阿齐兹国王科技城 (KACST) 授予 JK 和 AMA 作者声明不存在利益冲突。试用注册号 不适用。我们的数据首次表明，PLCze 的临床应用可能不仅有利于卵母细胞激活完全缺陷的特定男性不育人群（其中 PLCz 完全有缺陷/废除），而且可能还有利于更多寻求不孕症的夫妇。生育治疗。学习经费/竞争利益 JK 得到哈利法大学授予的教师启动补助金 (FSU-2023-015) 的支持。这项研究还得到了威尔士健康与护理研究中心 (HCRW) 授予 JK 的医疗保健研究奖学金 (HF-14-16) 以及国家科学、技术和创新计划 (NSTIP) 项目拨款 (15-MED4186- 20) 由​​阿卜杜勒阿齐兹国王科技城 (KACST) 授予 JK 和 AMA 作者声明不存在利益冲突。试用注册号 不适用。